天然氨基酸數量有限、結構保守，其構成的天然蛋白質已經無法滿足蛋白質工程以及蛋白藥物開發等領域的研究需求。

非天然氨基酸（non-natural amino acids, nnAAs）有結構多樣的側鏈基團，將其插入到蛋白質中可賦予蛋白質新的化學性質、結構及功能。非天然氨基酸插入為生物研究、生物治療學及合成生物學提供了新的途徑，在新興領域中應用前景廣闊：

（1）非天然蛋白質藥物開發：nnAAs特殊的化學功能基團極大地拓展了蛋白質藥物的設計空間，同時也為位點特異性偶聯開辟了新途徑，使抗體偶聯藥物具有良好的藥代動力學、效價和抗原結合特性。

（2）酶進化：傳統的酶或蛋白質工程依賴于用其余的19種天然氨基酸中的一種取代某一位點的某種氨基酸來改變酶或蛋白質的功能特性，而nnAAs的插入可以產生具有更高穩定性和改變催化性質的酶。

（3）非天然氨基酸探針：nnAAs作為高靈敏度的生物物理探針，可結合到重組蛋白質的特定位點，用于目標蛋白質的定量檢測及結構和功能的精確分析。

（4）蛋白質材料：nnAAs插入可以產生新型蛋白質聚合物，以用于合成生物材料，例如合成生物粘合劑等。

與細胞蛋白表達相比，無細胞蛋白表達系統在非天然氨基酸插入領域具有天然優勢：

（1）無細胞系統沒有細胞膜阻礙，規避了nnAAs選擇性問題；

（2）無細胞系統不受nnAAs可能產生的細胞毒性作用影響；

（3）有利于精細調控反應進程。

無細胞蛋白表達系統作為可靈活嵌入非天然氨基酸的強大技術臺，避免了nnAAs的跨膜及胞內運輸障礙、細胞生長毒性的問題，在研究蛋白質間相互作用、開發蛋白質藥物、新型蛋白材料方面發揮著至關重要的作用。

珀羅汀生物對綠色熒光蛋白（GFP）進行非天然氨基酸定點插入，在CFPS體系中成功表達了含非天然氨基酸（pAcF/pAzF）的GFP，其中pAcF插入效率超過70%。pAzF插入效率低于pAcF，這可能是由于pAzF的疊氮基在生理條件下不穩定，導致pAzF被還原為對氨基苯丙氨酸（pAF）。